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ELISPOT技術的優勢

時間:2017-07-18 09:27:09 瀏覽:

酶聯免疫斑點(ELISPOT)技術是當今世界上檢測生物體細胞免疫水平的最佳技術。它集高靈敏度、高可信度、高通量、單細胞水平、功能性檢測與低成本等諸多優點于一身,在國內外免疫學界獲得了廣泛的應用,成為主流免疫學檢測技術之一。我們來一一詳述這些優點。

一、靈敏度高

理論上,ELISPOT高達百萬分之一,也就是說哪怕一百萬個陰性細胞中只有一個陽性細胞,ELISPOT能把這個陽性細胞檢測出來。說來也沒什么神奇之處,只要細胞狀態好,陰性細胞就不會產生斑點。而有一個陽性細胞,就會產生一個斑點,反過來,一個斑點就證明了一個陽性細胞的存在,樣哪怕這個陽性細胞混雜在一百萬個陰性細胞中,ELISPOT能把這個陽性細胞檢測出來。

實踐中,由于一個ELISPOT孔容納不了100萬細胞,最多只能放萬細胞。再者,50-60萬陰性細胞出一兩個自發斑點也算正常,所以實驗組的孔要想有顯著的統計學意義,需要出4-5個斑點。這也就是說,只要陽性細胞頻率大于4個/60萬細胞,就可以被ELISPOT檢測出來。這算出來的實際靈敏度為十五萬分之一。這樣的靈敏度在一般客戶的實驗室都能達到,如果實驗再精細一些,細胞處理得再好一些,靈敏度還可以提高一倍,達到三十萬分之一。作為對比,采用流式細胞儀的方法(細胞內細胞因子染色法),對于陽性細胞的檢測靈敏度只有千分之一,比ELISPOT技術要低兩個數量級!

二、單細胞水平

與流式技術一樣,ELISPOT也是一種單細胞水平的檢測。作為對比,ELISA法、51Cr釋放法、細胞增殖實驗法都是群體水平的檢測。如果群體細胞因子水平提高,既有可能是分泌細胞因子的細胞數量增加,也有可能是分泌細胞的數量沒增加而單個分泌水平增加。這種區別對研究生物體的細胞免疫是很重要的,但是群體水平的檢測不能區別出來,只有單細胞水平的檢測能夠勝任。也就是說,單細胞水平的檢測可以提供更多的信息。

三、功能性檢測

ELISPOT檢測到的細胞因子不是實現存在的,而是在檢測的過程中,被加入的刺激物刺激而分泌出來的。斑點的強弱和數量反映了細胞對刺激物的反應能力和分泌細胞因子的能力,這是體現細胞免疫反應的最重要的功能指標。作為對比,ELISA只能檢測細胞的遺留物,充其量就是間接的反映了細胞功能。而流式細胞內細胞因子染色法需要的把本該分泌出來的細胞因子人為的囚禁在細胞之內,因能反映細胞應對刺激生產細胞因子的能力,不能反映其分泌細胞因子的能力,畢竟細胞因子要分泌到包外才能發揮功能活力。另外,流式方法也不能去除一類假陽性細胞,這類細胞的細胞因子含量豐富,但是沒有分泌功能。

四、實現高通量檢測

ELISPOT是在96孔微孔板上進行的,是一種高通量的檢測與篩選方法。一位有經驗的實驗者一次可以處理上百份細胞樣品與數十種抗原,測定它們的反應強度。作為對比,流式方法的樣品細胞需要在獨立的離心管中進行,遠未實現高通量,工作效率要低很多。

五、直觀,可信度高

相對ELISA法、流式細胞因子染色法、測CTL的51Cr釋放法而言,ELISPOT是最直觀的方法,一個陽性細胞一個斑點,清清楚楚,毫無疑問。只要實驗遵循標準化的操作方法,該檢測的重復性很好。另外,ELISPOT檢測的樣品細胞可以在液氮里面長期冷凍存放,治療(或者免疫)前后的細胞可以做對比檢測,細胞免疫水平的變化一目了然,可信度高。

六、檢測成本低

流式方法需要昂貴復雜的流式細胞儀,但是ELISPOT檢測并不需要特殊的儀器設備,充其量在檢測規模擴大了之后需要購置全自動的斑點圖像分析儀。另外,ELISPOT試劑相對于ELISA與流式抗體也要便宜很多。

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